여러 살모넬라 혈청형에 대한 파지 칵테일 개발 효과 및 생물막 제어 활성 비교 분석

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 13054(2023) 이 기사 인용

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식인성 질병은 전 세계 식품 산업, 특히 다제내성(MDR) 박테리아로 인해 발생하는 주요 문제입니다. MDR 균주 외에 생물막을 형성할 수 있는 박테리아는 치료 효능을 감소시켜 박테리아 제어에 심각한 위협을 가합니다. 박테리아를 감염시키고 죽이는 바이러스인 박테리오파지는 인간의 의약품과 동물 생산 모두에서 MDR 박테리아와 싸우는 유망한 대안으로 간주됩니다. 여러 파지로 구성된 파지 칵테일은 일반적으로 숙주 범위를 넓히고 파지 저항성의 발달을 방지하거나 지연시키기 위해 사용됩니다. 박테리오파지의 용균 활성을 평가하는 데 사용할 수 있는 다양한 기술과 프로토콜이 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 스팟 테스트 분석, EOP(도금 효율성) 및 액체 배양에서의 감염 분석입니다. 그러나 현재 파지의 숙주 범위와 칵테일 구성을 정확하게 결정하기 위해 분석을 사용해야 하는 표준화와 분석 간의 가능한 차이점은 없습니다. Spot Test Assay를 사용한 예비 선택으로 수많은 혈청형의 36개 살모넬라 분리물 패널에 대한 후속 평가를 위한 4개의 파지가 생성되었습니다. 액체 배양에서 EOP와 감염 분석을 비교하면 EOP가 파지의 용해 활성을 과소평가하여 파지 칵테일 발달에 직접적인 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌습니다. 더욱이, 선택된 4개의 파지를 포함하는 파지 칵테일은 EOP에 따르면 파지에 대한 낮은 감수성을 나타내는 것을 포함하여 분리된 균주의 66%(23/35)에 의해 형성된 생물막을 제어하거나 제거할 수 있었습니다. 파지는 게놈적으로 특성화되어 항생제 내성, 독성 인자 또는 인테그라제와 관련된 유전자가 없음을 나타냅니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 분석에 따르면, 액체 배양 및 96-웰 플레이트 생물막 생존성 분석에서 파지에 대한 높은 감수성을 나타내었지만 EOP에 대한 값은 낮은 살모넬라균 분리물의 생물막 성숙이 파지에 의해 억제되고 제어되는 것으로 밝혀졌습니다. 칵테일. 이러한 관찰은 파지가 낮은 EOP 값에도 불구하고 성장 및 성숙 과정 전반에 걸쳐 살모넬라균 생물막을 제어하고 제거할 수 있음을 나타냅니다. 또한, 액체 배양에서 감염 분석을 사용하면 칵테일 디자인을 위한 파지 상호 작용에 대한 보다 정확한 연구가 시간을 초월하고 수월하게 가능해집니다. 따라서 다양한 조건에서 숙주 범위와 박테리오파지의 용해 활성을 종합적으로 평가하기 위한 전략과 기술을 통합하면 파지 칵테일의 항균 잠재력을 보다 정확하게 보여줄 수 있습니다.

살모넬라균 전 세계적으로 공중 보건 위협으로 인식되는 빈번한 인간 병원체입니다1. 식중독 병원체 중에서 살모넬라균은 사망 원인 3위로 꼽히며, 따라서 상당한 경제적 부담을 안겨줍니다. 식중독의 세계적 부담에 관한 최신 세계보건기구(WHO) 보고서는 살모넬라균으로 인해 전 세계적으로 연간 8,800만 건의 사례가 발생하고 123,000명이 사망하고 총 222,000년의 수명이 장애를 안고 산 것으로 추정됩니다1.

Salmonella spp.의 주요 특징 중 하나입니다. 적대적인 환경에서 생존을 가능하게 하는 것은 표면과 관련된 복잡한 공동체, 즉 생물막의 형성입니다. 이는 특히 가금류 농장에서 증식을 통제하기 어렵게 만듭니다. 브라질에서 도살된 닭에서 분리된 살모넬라 균주의 50% 이상이 이러한 능력을 보여주기 때문입니다. 생물막을 형성합니다2,3,4,5. 생물막은 고분자 매트릭스 내의 세포 조직을 고려하여 살생물제에 대한 내성을 증가시키며, 이는 살생물제의 침투를 감소시키고 박테리아가 식품 가공 환경에서 장기간 지속되도록 합니다5,8.

따라서 다약제 내성 미생물의 출현으로 인해 항생제 사용을 줄이는 것을 목표로 가금류 생산에서 살모넬라를 제어하는 전략을 개발하는 것이 매우 중요합니다9,10. 이 시나리오에서 박테리오파지는 생물막11,12,13을 억제하거나 방해하는 물질로 관심을 얻고 있습니다.

0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.001./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001./p> 107 CFU/mL) of host strain, we assume that 100% phage adsorption has occurred soon following phage addition25./p>

0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) was observed for phage treated compared to 48 h biofilm control, indicating that the phages in the cocktail did not increase biofilms' growth for any tested isolates./p> 70%), they are from different species (< 95%). The intergenomic similarity between phB7 and phC17 is 86.5%, which also classifies them as different species in the same genus (Fig. 7b). This is reaffirmed by phylogeny analysis by VICTOR34, which grouped the four phages within the same family and genus. However, VICTOR results differentiated all the phages in different species, including phA11 and phC11, although their phylogenetic distance is low (Fig. 7c). This difference between VIRIDIC and VICTOR results regarding species level can be explained by the difference in the calculations and species thresholds used for each one. All four phages were classified in the class Caudoviricetes, family Demerecviridae, subfamily Markadamsvirinae, and genus Tequintavirus./p> 90%) with only five different phages, infecting Salmonella enterica, Shigella sp., and Escherichia coli. For phages phC17/phB7 endolysin genes, BLASTn showed high similarity (> 90%) with seventy-five different phages, infecting Salmonella enterica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae./p> 0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) increase the growth of the biofilm for any of the tested isolates in the analysis, reinforcing the high lytic activity of the selected phages. This is of special interest since specific phages modulate several properties of their host, including the possibility of increasing biofilm production45. A more detailed analysis of the interaction of the phages with the Salmonella biofilm can be seen in the CLSM images. At 24 h of incubation, the biofilm was not mature, but initial cell clusters can be observed with high thickness. A phage cocktail applied at this stage could stop the maturation of the biofilm by reducing the cell density and preventing cell clumping after an additional 24 h of incubation since the bacterial cells were not eradicated but are dispersed, which can be inferred as a certain level of phage resistant mutant cells. The elimination of bacteria from biofilm structure by phages shows differences in effects regarding the number of phages (individual phage or phage cocktail)46,47,48, the Salmonella serovars, the stage of biofilm maturation, and the composition of biofilm (mixed or single species)49. Combining phage therapy with alternative treatments or antibiotics can be an excellent strategy to eliminate resistant mutant cells and eradicate biofilms. A recent study by Duarte et al.50 described the synergistic activity of a single phage and a phage-derived lytic protein against staphylococcal biofilms, demonstrating that combining phages with lytic proteins might help curtail the development of phage resistance. The combination of phage with antibiotics was also effective against biofilms, as demonstrated by Dickey and Perrot51, showing the prevention of antibacterial-resistant bacteria, mainly when phage was used first and antibiotic second. However, antibiotic/phage combination must be carefully studied once it could increase the distribution of antibiotic resistance genes or have an antagonistic effect, especially with drugs that act inhibiting nucleic acid or protein synthesis52./p> 0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.00122. A Heatmap comparing EOP values was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software)./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001. A Heatmap comparing the v1 score for individual phages and the cocktail was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software). R v. 4.2.2 was used to plot the comparison of EOP and v1 in a dotplot graph./p>

4 × ODc = Strong biofilm producer./p>