16S rRNA 유전자 프라이머 선택이 영향을 미침

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12577(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

16S rRNA 앰플리콘 서열 분석 또는 최근에는 메타전사체 분석이 현재 인간 DNA와 박테리아 DNA의 비율이 우세한 샘플의 미생물 프로파일링에 선호되는 유일한 방법입니다. 그러나 인간 DNA의 표적 외 증폭으로 인해 현재 프로토콜은 생체 시료에 적합하지 않습니다. 여기서 우리는 인간 DNA 함량이 우세한 임상 샘플의 세균유전체 분석을 위한 효율적이고 신뢰할 수 있으며 저렴한 방법을 제시합니다. 우리는 V4 영역을 표적으로 하는 널리 사용되는 515F-806R(V4) 프라이머, 68F-338R 프라이머 및 수정된 세트 V1-V2 영역을 표적으로 하는 68F-338R(V1-V2M) 프라이머. V4 프라이머를 사용하면 평균 70%의 앰플리콘 서열 변이(ASV)가 인간 게놈에 매핑됩니다. 반면, V1-V2M 프라이머를 사용할 때는 이러한 표적 외 증폭이 나타나지 않았습니다. 또한 V1-V2M 프라이머는 V4 프라이머에 비해 훨씬 더 높은 분류학적 풍부함과 분석 재현성을 제공했습니다. 우리는 V1-V2M 16S rRNA 시퀀싱 방법이 신뢰할 수 있고 비용 효율적이며 의학 연구에서 박테리아가 풍부한 인간 샘플에 적용 가능하다고 결론지었습니다.

지난 10년 동안 배양 독립적인 높은 처리량 시퀀싱 방법을 사용하여 인간 박테리아군을 조사하는 것은 인체의 다양한 틈새에 서식하는 박테리아 공동체를 연구하는 데 가장 자주 사용되는 기술 중 하나가 되었습니다. 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 비용 절감과 결합된 3세대 기술에 대한 접근으로 인해 amplicon 16S rRNA 유전자 시퀀싱에서 대변, 인간 질3 또는 면봉과 같은 샘플에서 전체 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 메타유전체/메타전사체 시퀀싱으로 전환되었습니다. 인간 DNA와 박테리아 DNA의 우세한 비율을 포함하는 피부 또는 구강4. 그러나 박테리아 DNA 농도가 낮은 샘플이나 혈액, 소변 또는 인간 생검 샘플과 같은 숙주 DNA에 의해 "오염된" 샘플에서 박테리아유전체 프로파일링은 여전히 16S rRNA 유전자 서열 분석에 크게 의존합니다. 생성되는 데이터의 양이 상대적으로 적기 때문에 복잡한 생물정보학 분석5이 필요하지 않으며 가격도 저렴합니다. 반면에, 16S rRNA 앰플리콘 서열분석의 결과는 검색된 정보의 품질과 분류학적 특성에 따라 고도로 보존된 16S rRNA 유전자 서열 전체에 산재된 9개의 이용 가능한 가변 영역에서 초가변 하위 영역을 선택하는 데 결정적으로 의존합니다. 정확도는 사용된 프라이머 세트에 따라 크게 달라질 수 있습니다6. 현재 대부분의 연구는 EMP(Earth Microbiome Project)7의 널리 채택된 표준화된 프로토콜에서와 같이 V4 단일 가변 영역을 대상으로 하거나 Human Microbiome의 이중 색인 프로토콜에서와 같이 V1–V38 또는 V3–V59 가변 영역을 대상으로 합니다. 프로젝트(HMP). 이는 주로 널리 사용되는 Illumina 시퀀싱 플랫폼이 짧은 시퀀스(NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 염기 및 MiSeq ≤ 600 염기)만 생성하기 때문입니다. 불행하게도 최근 연구에서는 일반적으로 표적이 되는 16S rRNA 유전자 하위 영역 V4가 인체에 일반적으로 존재하는 분류군을 가장 정확하게 평가한다는 사실이 반복적으로 나타났습니다6,10,11. 또한 V3-V5 영역과 함께 특히 생검 샘플에서 인간 DNA12의 표적 외 증폭에 취약하여 희귀 분류군 및 박테리아 분해능이 손실될 가능성이 있으므로 상당한 비율의 데이터가 낭비됩니다.

여기서 우리는 식도, 위 및 십이지장의 생검 샘플에서 인간 DNA의 표적 외 증폭을 대폭 감소시키면서 알파 다양성과 분류학을 크게 증가시키는 V1-V2 16S rRNA 유전자 하위 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용하는 새로운 프로토콜을 보여줍니다. V4 영역을 표적으로 하는 일반적으로 사용되는 프라이머와 비교하여 정확도가 높습니다. 시퀀싱에 필요한 기능(플로우 셀 어댑터 및 인덱스)을 포함한 V1-V2 영역의 증폭 프라이머는 최대 판독 길이가 150bp인 Illumina MiniSeq 플랫폼에 최적화되어 수행에 관심이 있는 모든 실험실에 비용 효율적인 옵션을 제공합니다. 높은 처리량의 16S rRNA 유전자 시퀀싱. 분류학적 분류의 성능을 더욱 높이기 위해 우리는 생물정보학 파이프라인에 대한 쌍방향 읽기 연결을 포함했습니다.

0.5%) between the datasets from the esophagus and duodenum biopsies showed increased representation of the abundant genera Prevotella, Fusobacterium, and Streptococcus in the V4 dataset and Neisseria, Haemophilus and Rothia in the V1–V2M dataset (Fig. 6). In biopsies from the stomach, we observed increased representation of abundant genera Prevotella and Fusobacterium only in the V4 dataset (Fig. 6). Indeed, the genus Tmx7 was nearly absent from all V4 datasets, and the genus Leptotrichia was nearly absent from V1–V2M datasets (Fig. 6)./p> 1% abundance and compared with our data (Fig. 7). Both data sets, V1–V2M and V4, showed a very high degree of correlation with the bacterial communities in the two standards (Fig. 7B,D). In the case of GM standard, the V4 primers slightly underestimated the genera Veilonella and Limosilactobacillus and the V1–V2M primers slightly underestimated the genus Bacteroides. An analysis of the FRT community showed a slightly higher representation of the genera Bacteroides, Agathobacter and Subdoligranulum in the V4 primer data set and of Anaerostipes in the V1–V2M data set. In general, however, these results show that the V1–V2M primers give comparable data to the V4 primers./p>