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형질세포의 선택적 농축
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형질세포의 선택적 농축

Jul 19, 2023

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 885(2023) 이 기사 인용

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세포외 소포(EV)는 세포외 소형 RNA 수송의 핵심 중재자로 나타났습니다. 그러나 인간 생체유체 내 무세포 전령 RNA(cf-mRNA)의 운반체와 암과의 연관성은 여전히 ​​잘 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 폐암, 간암, 다발성 골수종 및 건강한 기증자의 크기 분할 혈장에 대한 전사체 분석을 수행했습니다. 형태 및 크기 분포 분석을 통해 다른 용해성 혈장 단백질 분획에서 대형 및 중간 입자가 성공적으로 분리된 것으로 나타났습니다. 우리는 기술적 가변성을 제어하고 각각에 포함된 cf-mRNA 양의 본질적인 급격한 차이를 정규화하기 위해 RNA 스파이크인을 구현하여 입자 및 단백질이 풍부한 하위 집단에서 초미량의 cf-mRNA를 정제하고 서열 분석하는 전략을 개발했습니다. 혈장 분획. 우리는 cf-mRNA의 대부분이 RNase가 풍부한 환경에서 놀라운 안정성으로 EV에서 농축되고 보호된다는 것을 발견했습니다. 우리는 각 입자 및 단백질 농축 하위 집단에서 암 관련 cf-mRNA의 특정 농축 패턴을 관찰했습니다. EV가 풍부한 분화 유전자는 각각 폐암, 간암 및 다발성 골수종의 면역 체계, 간 기능 및 독성 물질 조절과 같은 특정 생물학적 경로와 관련이 있습니다. 우리의 결과는 EV 하위 집단의 복잡성을 해부하는 것이 생물학적 중요성을 밝히고 유망한 액체 생검 접근법을 제공한다는 것을 시사합니다.

세포외 RNA(exRNA)라고도 알려진 무세포 RNA(cfRNA)는 뇌척수액(CSF), 타액, 혈청, 소변 및 혈장을 포함한 많은 체액에 존재합니다1,2,3. 가장 일반적으로 보고되는 cfRNA 바이오타입은 microRNA(miRNA), transfer RNA(tRNA) 단편 및 piwi 상호작용 RNA(piRNA)4를 포함하는 작은 비암호화 RNA(ncRNA)입니다. 연구에 따르면 생체유체5,6,7,8,9에서도 메신저 RNA(mRNA)와 긴 비암호화 RNA(lncRNA)가 발견되었습니다. cfRNA는 혈액 내 RNase 수준이 높기 때문에 무세포 DNA보다 더 취약하고 덜 풍부한 것으로 간주되어 왔지만, 여러 연구에서 혈액에 존재하는 miRNA가 현저히 안정적이라는 것이 입증되었습니다11,12. 많은 cfRNA 연구는 체액에서의 안정성으로 인해 cf-miRNA를 특성화하는 데 중점을 두었습니다11,12. 그러나 우리와 다른 사람들은 최근 cf-mRNA가 비침습적 바이오마커로 활용될 수 있는 안정적이고 질병 특이적 시그니처를 전달할 수 있음을 입증했습니다8,13,14,15,16,17,18.

cfRNA는 세포외소포(EV), 리보핵단백질 및 유미미크론, 초저밀도 지질단백질(VLDL), 저밀도 지질단백질(LDL) 및 고밀도 지질단백질(HDL)과 같은 지질단백질을 포함한 다양한 하위 클래스의 운반체와 연관되어 있습니다. 다양한 운반체에 포장된 RNA 화물의 유형과 비율은 생체유체 유형, 분석 전 요인, 생리학적 또는 병리학적 조건에 따라 달라질 수 있습니다. NIH 세포외 RNA(exRNA) 통신 컨소시엄은 19개 연구에 걸쳐 전산 디콘볼루션을 통해 miRNA의 주요 운반체를 광범위하게 비교하는 exRNA 아틀라스 리소스를 만들었습니다2,19. 이러한 비교 통계 연구에서는 알려진 수포성 및 비수포성 운반체2와 관련된 5가지 miRNA 화물 유형이 확인되었습니다. 이러한 연구에서는 EV가 RNA 수송의 주요 중재자임을 암시하는 반면, 다른 연구에서는 RNA 결합 단백질 복합체가 인간 혈장의 소포와 독립적으로 miRNA를 운반할 수 있음을 보여주었습니다12,13,20. RNase가 풍부한 혈장에서 안정성을 제공하는 cf-mRNA 운반체를 식별하면 기본적인 생물학과 기능은 물론 임상 적용을 위한 운반체 특이적 바이오마커의 잠재적인 독특한 형태를 밝힐 수 있습니다. 조절된 세포 배양 배지에서 cf-mRNA는 EV와 연관되어 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 인간 생체유체에서 어떤 운반체가 cf-mRNA와 연관되는지는 아직 잘 규명되지 않았습니다1,21.

 0.05; *P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001) with three technical replicates of FR14 and FR58 of plasma pooled from three healthy individuals. c A box plot of negative raw cycle threshold (- raw ct) of individual genes with RNase and/or detergent treatment using qRT-PCR. RNA isolated from combined FR14 and FR58 using three healthy individuals and three technical replicates of control RNA were treated with RNase and/or detergent. Data are analyzed using RStudio and reported as means ± SD of three independent samples./p> 1) between each cancer type and healthy controls within a specific fraction (Fig. 5a). We used permutation tests to evaluate the statistical significance of DE analysis (Supplementary Fig. 9). To analyze the enrichment patterns, we calculated fold change of these DE genes identified between each cancer type compared with controls within each fraction and visualized in a heatmap (Fig. 5a). We found that, compared to healthy controls, the fractionated plasma of lung cancer patients had significantly upregulated mRNAs, specifically 136, 199, 462, 151, 105, and 7 within medium EVs, small EVs, non-EV particles, early-, middle-, and late-eluting protein fractions respectively (Supplementary Fig. 10a). Intriguingly, the heatmap visualization of fold changes in cancer patients compared with healthy controls displayed distinct enrichment patterns of lung cancer-differentiating cf-mRNA, specific to EV and protein subpopulations (Fig. 5b). The majority of DE genes are enriched in specific EV and protein fractions with very few DE mRNA being shared between fractions (Supplementary Fig. 10). To assess the potential roles of these selectively enriched cancer distinguishing gene sets in each plasma fraction, we performed pathway enrichment analysis using g:Profiler curated on gene ontology and Reactome databases, Cytoscape, and EnrichmentMap (Fig. 5a). Differentiating genes enriched in FR14 (medium EVs) from lung cancer were associated with both immune system and metabolic process (Fig. 5c), while DE genes enriched in FR912 (non-EV particles fraction) were implicated in the immune system and myeloid leukocyte mediated response (Fig. 5c). Differentiating genes enriched in FR1619 (early-eluting protein) from lung cancer were enriched in protein localization nucleus, steroid hormone corticosteroid, and defense virus symbiont, while DE genes enriched in FR3033 (late-eluting protein) were enriched in sphingolipid metabolism (Fig. 5c)./p> 1). After DE genes were identified, log2 fold change (log2FC) was calculated by subtracting log2 counts of cancer from individual biological replicates to the mean of corresponding healthy fractions. Gene lists were organized by fraction. DE genes were identified for selective packaging heatmap analysis. Using the DE genes identified from each fraction, g:Profiler was performed on gene ontology biological properties and reactome for functional enrichment analysis. Pathway enrichment analysis was performed using Cytoscape and EnrichmentMap. b Heatmap of gene expression in lung cancer relative to healthy across fractions. c Enrichment map for lung cancer DE genes found in individual fractions using Gene Ontology (Biological properties) and Reactome with FR14, FR912, FR1619, and FR3033 color coded by red, green, purple and yellow, respectively. Cluster represents (i) steroid hormone corticosteroid, (ii) Cellular response chemical, (iii) defense virus symbiont, (iv) regulation myeloid cell, (v) negative regulation response, (vi) toll cell receptor 4, (vii) g1 specific transcription, and (viii) hemidesmosome assembly. Cluster of nodes were automatically labeled using the AutoAnnotate from Cytoscape./p> 1) per cancer type compared to healthy controls within each fraction. Intriguingly, our heatmap visualization of enrichment patterns revealed distinct multiple cancer differentiating cf-mRNA specific to EV and protein fractions (Fig. 6a). Although there is a slight increase in expression of cf-mRNA between small EV-associated lung cancer DE genes with multiple myeloma and liver cancer, the majority of these genes were not differentially expressed within multiple myeloma and liver cancer. In addition, we performed functional enrichment analyses on these combined gene sets and found the majority of biological function related terms were unique for each cancer type and fraction with minimal overlap on humoral response antimicrobial from both FR14 of lung cancer and FR2326 of multiple myeloma (Fig. 6b). These overall selective enrichment patterns associated with multiple cancers within EV subpopulations and protein fractions suggests that distinct cf-mRNA are packaged into different types of extracellular carriers in cancer./p> 1. To test the significance of the differential expression results for each pairwise comparison of cancer to healthy control per fraction, we performed a permutation test in which differential expression analysis between two groups of randomized samples was compared using the DESeq2 package. For each pair, 1000 permutations of random shuffling were performed and the number of differentiating genes with padj < 0.05 were documented for building a histogram, and compared to the number of significant genes (padj < 0.05) for the group with correct labeling./p> 1 from DESeq2 (v1.22.2). For DegPattern analysis from R package DEGreport (v1.18.1), a total of 11,577 differentially expressed genes determined by one-way ANOVA test across plasma fractions with false discovery rate less than 0.05 were used./p>