비검사

Nature Communications 14권, 기사 번호: 5294(2023) 이 기사 인용

측정항목 세부정보

Saccharomyces cerevisiae는 알코올 발효에서 유기체의 탁월함과 대사를 조작하는 데 사용할 수 있는 정교한 유전 도구 세트로 인해 산업 생명공학의 주력 제품입니다. 그러나 S. cerevisiae는 독성으로 인해 높은 역가에서의 생산이 제한되기 때문에 많은 벌크 생물산물을 과잉 생산하는 데 적합하지 않습니다. 여기에서는 나일론 전구체인 20g L−1 아디프산(AA)에 대한 내성에 대해 공개적으로 접근 가능한 108개의 효모 균주를 선별하기 위해 높은 처리량 분석을 사용합니다. 우리는 15개의 내성 효모를 식별하고 AA의 전구체인 cis,cis-muconic acid(CCM) 생산을 위해 Pichia occidentalis를 선택합니다. P. occidentalis에 대한 게놈 편집 툴킷을 개발함으로써 우리는 최대 역가(38.8g L−1), 수율(0.134g g−1 포도당) 및 생산성(0.511g L−1h−1)을 갖춘 CCM의 유가식 생산을 입증합니다. ) 이는 S. cerevisiae를 사용하여 달성한 모든 지표를 능가합니다. 이 연구는 우리를 AA의 산업적 생물생산에 더 가깝게 만들고 생물공정에서 숙주 선택의 중요성을 강조합니다.

역사적으로 맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 연료, 화학 물질 및 의약품의 과잉 생산에 선호되는 미생물 숙주였습니다. 그러나 많은 벌크 화학 물질과 바이오 연료의 가치가 낮기 때문에 상업적 규모의 생산에 필요한 농도는 종종 S. cerevisiae 및 기타 모델 유기체에 독성이 있습니다. 예를 들어 S. cerevisiae는 중저농도의 부탄올(2%)1, 바닐린(0.05%)2, 벤즈알데히드(0.1~0.2%)3 및 많은 유기산(0.25~2.5%)에서 성장을 유지할 수 없습니다. 4,5,6. 이상적인 유기산 바이오프로세스는 산성 pH에서 수행되므로 유기산은 분리되지 않은 형태의 하류 복구를 단순화하고 발효 중 pH 유지 요구 사항을 회피하므로 뚜렷한 바이오프로세싱 문제를 제기합니다. 그러나 해리되지 않은 산(pH < pKa)은 세포 내로 자유롭게 확산되고 세포질(pH 5~7)에서 해리되기 때문에 산 독성은 pH에 반비례합니다7. 따라서 제품 독성을 피하기 위해 대부분의 유기산 생산 균주인 S. cerevisiae 및 기타 미생물의 배양은 pH > pKa8,9,10에서 수행됩니다.

아디프산은 나일론 6,6 생산에 사용되는 C6 디카르복실산입니다. 연간 생산량이 300만 톤이고 세계 시장 규모가 60억 달러에 달하는11 아디프산은 미국 에너지부에 의해 '슈퍼 상품'으로 분류되었습니다12. 아디프산에 대한 전 세계 수요는 현재 사이클로헥산과 질산을 포함하는 화학 공정을 통해 충족되지만, 이 방법은 석유화학 자원을 활용하고 강력한 온실가스인 아산화질소를 방출하므로 보다 지속 가능한 생산 경로에 대한 연구가 촉발되고 있습니다. 아디프산 생합성을 위한 자연 경로는 없지만 생물생산을 위해 최소한 8가지 공학적 생화학적 경로가 제안되었습니다11. 이러한 경로 중에서 cis,cis-muconic acid(CCM) 경로를 사용하여 주요 진전이 이루어졌습니다. 이 전략은 시키메이트 경로의 중간체인 3-데히드로시키메이트로부터 CCM을 합성하기 위해 3가지 이종 효소인 3-데히드로시키메이트 탈수효소, 프로토카테츄산 탈탄산효소 및 카테콜 디옥시게나제를 사용합니다. CCM은 에노에이트 환원효소 효소에 의한 수소화를 통해 아디프산으로 전환되지만, 현재까지 특성화된 박테리아 변종은 효모 숙주13에서 제대로 기능하지 않아 CCM에서 아디프산으로 <0.9% 몰 전환을 달성합니다. 적합한 효모 활성 에노에이트 환원효소가 없는 경우 S. cerevisiae는 최대 22.5g L−1, 0.1g g−1 포도당 및 0.21g L−1의 역가, 수율 및 생산성으로 CCM을 합성하도록 조작되었습니다. h−1, 각각9,10. 이러한 발전에도 불구하고 효모 CCM 공정은 pH 5~6에서 수행됩니다. 이는 CCM의 pKa(3.87)보다 훨씬 높으며 제품 독성을 제한하기 위해 산을 해리된 형태로 유지합니다.

많은 벌크 생물산물에 대한 S. cerevisiae의 낮은 내성에 대응하여 산업 응용에 더 적합한 표현형에 대한 비전통적 효모 종을 스크리닝하는 데 초점이 옮겨졌습니다15. 균주 선택은 생물공정 개발에서 중요하면서도 종종 간과되는 측면입니다. 목표 최종 제품에 맞는 미생물 숙주를 선택하면 균주 엔지니어링 개입이 줄어들고, 다운스트림 분리가 단순화되며, 제품 독성이 제한되고, 전반적인 공정 지표가 향상될 가능성이 높기 때문입니다16. 예를 들어, 야로위아 리포라이티카(Yarrowia liplytica)는 지방산과 알칸 생산에 매우 적합한 유지성 삼투압 숙주이고17, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)는 빠르게 성장하는 내열성 효모18이며, 피치아 쿠드리아브제비(Pichia kudriavzevii)는 다양한 생산에 활용되는 강력한 내산성 숙주입니다. 유기산19. 약 1,500종의 효모가 100개 이상의 속으로 분류되었으며, 공공 배양 저장소에는 수천 개의 개별 효모 균주가 포함되어 있습니다. 이러한 효모 종의 대부분은 표준 배지20를 사용하여 실험실에서 배양할 수 있으며 게놈 서열 분석, 시스템 생물학 및 균주 공학의 주요 발전으로 비전통적 숙주의 유전적 가축화에 관련된 비용과 노동력이 극적으로 감소했습니다. Y. lipolytica21, K. marxianus18 및 P. Pastoris22를 포함한 다양한 효모 종을 위한 정교한 유전적 툴킷이 개발되어 Saccharomyces를 넘어 숙주 선택을 위한 새로운 기회를 제공합니다.