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인간 거대세포바이러스 하위바이러스 조밀체와 배양 시 섬유아세포 및 내피 세포의 단백질체 변화
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인간 거대세포바이러스 하위바이러스 조밀체와 배양 시 섬유아세포 및 내피 세포의 단백질체 변화

Jul 22, 2023

과학 데이터 10권, 기사 번호: 517(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

인간 거대세포 바이러스(HCMV)는 의학적 관련성이 높은 병원체입니다. Subviral Dense Body(DB)는 HCMV 감염의 심각한 결과를 개선하기 위한 백신 후보로 개발되었습니다. 인간에게 적용할 수 있는 후보 백신을 개발하려면 숙주와의 상호 작용에 대한 자세한 지식이 필요합니다. DB에 노출된 세포배양세포의 프로테옴 변화에 대해 종합적인 질량분석법(MS) 기반 분석을 수행했습니다.

인간 거대세포 바이러스(HCMV)는 β-헤르페스 바이러스이며 전 세계적으로 선천성 감염의 주요 원인으로 청력 상실, 시각 장애 또는 인지 장애와 같은 수많은 후유증을 초래합니다1. 전신 면역억제 상황에서 HCMV 감염은 상당한 이병률과 사망률을 초래할 수 있습니다1. HCMV에 감염된 섬유아세포는 조밀체(Dense Body)라고 불리는 다량의 비감염성 입자를 세포 배양 상층액으로 방출합니다2,3. 분리된 DB의 질량 분석은 단백질 구성을 밝히는 데 기여했으며 HCMV4,5에 대한 적응 면역 반응의 중요한 항원의 존재를 밝혀냈습니다. 한편, 시험관 내 실험 및 동물 연구에서는 DB가 특히 면역원성이고 강력한 인터페론(IFN) 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다6,7,8,9,10,11. 결과적으로 DB는 HCMV에 대한 유망한 백신으로 간주되었습니다. 임상 시험에서 후보 백신을 인체에 적용하고 최종 허가를 받기 위해서는 잠재적인 부작용과 내약성을 평가하기 위해 백신이 숙주 세포에 미치는 영향에 대한 포괄적인 지식이 중요합니다. 배양 섬유아세포 및 내피 세포에 대한 DB의 영향에 대한 데이터 세트는 질량 분석법(MS)을 사용하여 생성되었습니다. 이러한 데이터 세트는 인터페론-β 반응의 조사와 DB 노출 시 섬유아세포 및 내피 세포의 인터페론 자극 유전자(ISG) 발현 유도에 초점을 맞춘 이전 간행물에서 사용되었습니다.

일차 인간 포피 섬유아세포(HFF)는 1994년 신생아의 포피에서 확립되었으며 과거에는 연구에 사용되었습니다6,7,14,15,16. 연구에 이러한 세포를 사용하는 것에 대한 승인은 독일 라인란트팔츠 의료위원회 윤리위원회로부터 얻었습니다. HFF는 5% 태아 송아지 혈청(FCS), 100 mg/l L-글루타민, 0.5 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, Invitrogen, 독일 카를스루에) 및 겐타마이신(5 mg/l). 실험을 위해 16에서 19 사이의 HFF 세포 계대 번호가 사용되었습니다. HEC-LTT 세포는 Dagmar Wirth와 동료에 의해 확립되었습니다. 세포는 SV40 대형 T 항원과 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT)의 테트라사이클린 의존적 발현으로 조건부로 불멸화된 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 유래되었습니다. 배양을 위해 배양 용기를 0.1% 젤라틴(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;)으로 30분 이상 코팅하였다. HEC-LTT 세포는 2 μg/mL 독시사이클린(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)이 보충된 내피 성장 배지(EGM BulletKit, Lonza Sales Ltd., Basel, Switzerland)에서 유지되었습니다. HEC-LTT 세포의 증식은 독시사이클린(DOX)에 의해 제어될 수 있습니다. DOX를 첨가하면 불멸화 단백질인 hTERT와 SV40 Large-T 항원의 발현이 활성화되어 세포 증식이 일어납니다. 전체 실험에서 독시사이클린은 생략되었습니다. 연구 목적으로 HEC-LTT 세포를 사용할 수 있는 허가는 헬름홀츠 감염 연구 센터(HZI)의 물질 이전 계약을 통해 부여되었습니다. 세포는 HCMV 감염을 허용하는 것으로 나타났습니다18. HEC-LTT는 Christian Sinzger(독일 울름 소재 울름대학교 의료원 바이러스학 연구소)에서 친절하게 보내주셨고, 통로 41부터 통로 55까지의 실험에 사용되었습니다.

1.0-fold with p-value < 0.05 (green dots), and 35 proteins that were decreased by < − 1.0-fold with p-value < 0.05, (red dots). The HCMV tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and its detection was used as a positive control, indicating DB internalisation into HFF. The volcano plot was generated using the R software. (b + c) Protein-Protein Interaction (PPI) analysis and functional classification of the regulated proteins in HFF after DB-stimulation. (b) Display of the STRING PPI network generated upon entering the 68 regulated proteins into the STRING database. The network nodes represent all the proteins produced by a single protein-coding gene locus. Nodes are coloured according to their function in the indicated biological processes in c. Grey nodes indicate proteins connected to the input proteins but without association with the biological processes. Connections reflect protein interaction and the line thickness indicates strength of the data support, using a high confidence cut-off with a score of 0.7. Proteins with no interaction to other proteins in the network were removed. (c) Bar chart of the biological processes, connected to the proteins that were found to be regulated in HFF after DB-stimulation. The arrangement was performed according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) Heatmap of the 45 altered ISGs. The expression patterns were arranged hierarchically based on the mean of the log2 converted normalized ratio from 5 biological replicates. The log2FC is represented with a colour gradient. IFN, Interferon; ISG, Interferon-stimulated gene; STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p> 1.0; p < 0.05). Blue dots indicate differentially expressed proteins that were significantly upregulated (fold change < 1.0; p < 0.05). The viral tegument protein pp65 (UL83) is highlighted in orange and was used as a control for DB internalisation into ECs. The volcano plot was generated using the R software. (b) STRING Protein-Protein Interaction network of the 83 proteins that were differentially expressed in ECs upon DB treatment. Proteins with no associations to other proteins in the network were removed. Network nodes represent all the proteins produced by a single, protein-coding gene locus. Lines depict protein interaction and the line thickness indicates the strength of the data support with a minimum confidence cut-off of 0.7 (high confidence). (c) Bar chart of the enriched biological processes associated with differentially expressed proteins. The top ten enriched biological processes are arranged according to increasing False Discovery Rates (FDR). The y-axis represents biological process categories, while the x-axis indicates the number of genes involved in each category. (d) 60 differentially regulated proteins were designated as IRGs. The log2FC is represented with a colour gradient. The 20 up-regulated ISGs are indicated in blue and the 40 down-regulated ISGs are indicated in red. STRING, Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes./p>