기능성 생체외 분석을 위한 Plasmodium vivax 바이오뱅크 개발

말라리아 저널 22권, 논문 번호: 250(2023) 이 기사 인용

측정항목 세부정보

Plasmodium vivax는 말라리아의 두 번째로 흔한 원인이지만 지속적인 시험관 내 배양 시스템의 부족으로 인해 연구하기가 여전히 어렵습니다. 이는 기능 분석에 사용하기 위해 샘플당 여러 번의 동결을 통해 임상 분리균의 바이오뱅크를 구축해야 할 필요성을 강조합니다. 기생충 분리물을 냉동보존하는 다양한 방법을 비교한 후 가장 유망한 방법이 검증되었습니다. 분석 계획을 용이하게 하기 위해 초기 및 후기 단계 기생충의 농축과 기생충 성숙을 정량화했습니다.

냉동보존 프로토콜을 비교하기 위해 9개의 임상 P. vivax 분리주를 4개의 글리세롤라이트 기반 혼합물로 냉동했습니다. 해동 후, KCl-Percoll 농축 후 및 단기 시험관 배양에서 기생충 회복을 슬라이드 현미경을 통해 측정했습니다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의한 후기 단계 기생충의 농축을 측정했습니다. -80 °C 또는 액체 질소에서 기생충의 단기 및 장기 저장도 비교되었습니다.

4개의 냉동 보존 혼합물 중 하나의 혼합물(2.5:1.5:1 비율의 글리세롤액:혈청:RBC)은 단기 체외 배양에서 기생충 회복이 향상되고 통계적으로 유의미한(P < 0.05) 향상을 가져왔습니다. 이후 이 프로토콜을 사용하여 기생충 바이오뱅크를 생성하여 각각 8개의 바이알이 있는 106개의 임상 분리주를 수집했습니다. 바이오뱅크의 품질은 47번의 해동에서 여러 요인을 측정하여 검증되었습니다: 해동 후 기생충혈증의 평균 감소(25.3%); KCl-Percoll 이후 평균 배수 농축(6.65배); 및 기생충의 평균 회수율(22.0%, 30개 분리주에서 측정). 단기간의 시험관 배양 동안, 고리 단계 기생충이 후기 단계(> 20% 영양체, 분열체 및 배우자세포)로 강력하게 성숙하는 것이 48시간까지 분리된 개체의 60.0%에서 관찰되었습니다. MACS를 통한 성숙 기생충 단계의 강화는 MACS 후 기생충혈증의 평균 30.0% 및 평균 5.30 × 105 기생충/바이알로 우수한 재현성을 나타냈습니다. 마지막으로, 저장 온도의 영향을 테스트한 결과, -80°C에서 단기(7일) 또는 장기(7~10년) 저장 시 기생충 회복, 농축 또는 생존 가능성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다.

여기에서는 P. vivax 임상 분리물에 대한 최적화된 동결 방법이 기능 분석에 사용하기 위한 기생충 바이오뱅크의 생성 및 검증을 위한 템플릿으로 입증되었습니다.

Plasmodium vivax는 지리적으로 가장 널리 퍼진 말라리아 기생충 종이며 전 세계적으로 두 번째로 높은 말라리아 부담을 담당합니다. P. vivax의 전체 발병률은 전 세계적으로 2000년 2,050만 건에서 2021년 490만 건으로 감소했지만[1], P. vivax 백신의 부족, P. vivax에 대한 저항성 증가 등 이 병원체를 근절하려는 노력에는 상당한 장애물이 남아 있습니다. 항말라리아제.

P. vivax의 기본 생물학에 대한 연구는 지속적인 시험관 배양 시스템의 부족으로 인해 심각하게 제한되었습니다 [2,3,4]. 이러한 지속적인 배양 부족으로 인해 실험 조사를 위해 임상 P. vivax 분리균을 사용해야 하며, 이러한 분리균에 대한 제한된 접근으로 인해 이 기생충에 대한 지식을 발전시키는 데 방해가 되었습니다. 최근 P. vivax에 대한 단기 체외 배양 접근법이 확립되어(어떤 경우에는 냉동보존 분리주 사용 포함)[3, 5, 6], 단일 주기 약물 저항성 분석을 수행할 수 있게 되었습니다[3, 7] 뿐만 아니라 숙주 망상적혈구 친화성[8], 침입 억제 항체[9,10,11,12,13,14,15,16] 및 숙주 수용체 돌연변이의 효과[17, 18]를 평가하기 위한 침입 분석도 포함됩니다. Plasmodium falciparum[22,23,24]을 포함하여 바이오뱅킹 감염성 질병 샘플의 중요성에 대한 인식이 증가하고 있습니다[19,20,21]. 다운스트림 실험(기능 분석, 유전자 발현 분석, 유전체학)을 위해 안정적으로 해동할 수 있는 냉동보존된 P. vivax 분리주의 바이오뱅크 생성은 해당 분야의 추가 발전을 위한 중요한 자원이 될 것입니다[4].

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>